摘要： 利用由细菌内毒素脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱发肾小球肾细胞（mesangial cells）的炎症反应，通过牛樟芝粗萃取物（ACE）及纯化物Antrocamols对肾小球肾细胞（mesangial cells）发炎反应的抑制能力。结果显示，牛樟芝酒精萃取物（ACE）在5分钟内浓度在0.024 mg/ml时，可降低由LPS所诱发的氧化压力。利用巨噬细胞（Macrophage cell)检测平台侦测牛樟芝酒精萃取物（ACE)在5分钟内浓度在0.78125mg/ml时，可降低由LPS所诱发的氧化压力。Antrocamol LT1(ANCA-D-34）在0.048mg/ml可抑制氧化压力（ROS)连14%。Antrocamol LT3（ANCA-D-352）在0.048mg/ml可抑制发炎反应（MCP-1）速40.2%。说明牛樟芝酒精萃取物（ACE)及其纯化物Antrocamols对肾小球肾细胞（mesangial cells）发炎反应有抑制能力。以Antrocamol LT1(ANCA-D-34）的抑制氧化压力效果最好，以Antrocamol LT3(ANCA-D-352)的抑制发炎反应效果最好。
关键词： 牛樟芝；安康酚；肾小球细胞；肾小球肾炎
牛樟芝（Antrodia camphorata）， 又称樟芝、牛樟菇或红樟芝等，属于非褶菌目（Aphyllophorales）、多孔菌科（Polyporaceae）之多年生草菌类，为台湾特有种真菌，专生长于台湾保育类树种一牛樟树（Cinnamomum kanehirai Hay）之中空腐朽心材内壁上。由于牛樟树分布数量极稀少，加上人为的盗伐，使得寄生於其中方能生长之野生牛樟芝数量更形稀少，且由于其子实体生长相当缓慢，生长期亦专在六月至十月之间，因此价格非常昂贵。在台湾民俗医学上，牛樟芝具有解毒、减轻腹胀症状、消炎、治肝病相关疾病及抗癌等功用。牛樟芝如同一般食用之蕈菇类，具有多复杂成分，已知的生理活性成分中，包括：三萜类化合物（triterpenoids）、多糖（polysaccharides，如β-D-葡聚）、腺苷（adenosine）、维生素（如维生素B、叶酸）、蛋白质（含免疫球蛋白）、超氧化物歧化酵素（superoxide dismutase，SOD）、微量元素（如：钙、磷、锌）、核酸、固醇类以及血脂稳定物质（如antodiaacid)等，这些生理活性成分被认为具有抗癌、增加免疫能力、抗过敏、抗病菌、抗高血压、降血糖及降胆固醇等多种功效。同时在近年来，已开始逐渐发现其中的特定成分可能具有抗发炎的功效，特别是可用于治疗肾小球疾病等。
一般常见的肾脏疾病，常是通过攻击肾小球而影响肾脏功能。肾小球疾病包括多种基因及环境因素所引起的多病症，但不外乎主要分成肾小球硬化症及肾小球肾炎两大类。肾小球硬化症指肾中之肾小球硬化。一般指肾小球的微血管、肾小球、及用以滤血液遇滤尿液之肾功能单位受损。蛋白尿（尿液中量最多的蛋白质）为肾小球硬化症之症状之一。肾小球损伤会影响肾过滤功能，且造成蛋白质由血液渗漏至尿液中。然而，肾小球硬化症是尿蛋白许多的成因之一。而肾小球切片可能是一种判断病人是否患肾小球硬化症或其他肾脏疾病之必要判断依据。肾小球硬化症，可特别指局部性肾小球硬化症（FSGS）及结节性肾小球硬化症。
局部性肾小球硬化症（FSGS）是以局部肾小球硬化及足细胞足突扁平化（foot process effacement)之损伤特征来判断。近20年的研究显示，患有FSGS病患其末期肾脏疾病发生率介于13至78%之间。虽然FSGS病源及发病原因尚未清楚，但主要应考虑是起因于肾小球上皮细胞本身损害，而造成肾小球中复杂的反应产生，进而造成肾小球硬化。
结节性肾小球硬化症或毛细血管间肾小球肾炎，亦可称为糖尿病肾病变（糖尿病肾病）或基-威二氏症（Kimmelstiel-Wilson syndrome），是一种进行性肾病，其是起因于肾小球之毛细血管病。此病的特征是肾病变及弥漫性肾小球硬化；主要起因于长时间罹患糖尿病，且各种的主要治疗方式是洗肾。
台湾目前约有6万人因慢性肾衰竭供尿毒症而需长期洗肾，且每年新增多达2000位洗肾患者，影响国人的健康甚钜，因此护肾相关之保健品需求量相当大。
截至目前为止，当然类固醇及免疫抑制为主要用於治疗罹患原发性FSGS之方法，但这些疗法对於肾损伤发展的治疗上效果仍然有限，且因其会产生各种副作用，故治疗方法往往是基于经验法则，而较少根据病理证。
肾小球肾炎则指肾小球组织的发炎反应，肾小球肾炎主要是肾小球损伤而引起之肾小球疾病。肾小球主要是由一簇微血管组成，管壁包含血管内皮细胞、基底膜（Basement Membrane；BM）和上皮细胞等部分，且形成微血管环（Capillary Loop）；许多微血管环聚合成微血管（Capillary Tufts），其中心轴由间质细胞（Mesangial Cells）组成。间质细胞具有吞噬或运送循环中之大分子物质至远曲小管。其中膜组织具有过滤功能，而可从血液中分离废物及多余水分。
最常见的肾小球肾炎为免疫球蛋白A型肾小球肾炎（IgAN），造成此肾炎加速发展之病因仍无法预测，且临床上仍无法预防及治疗，故被视为可能造成肾病的慢性肾衰竭之主要因素之一。因此，在IgAN病患之肾小球中，即便其他免疫上、临床上及病理上的因素会造成肾衰竭，但系统性T细胞活化及淋巴球/巨噬细胞/嗜中性白血球浸润等不正常增加，被认为是造成IgAN发展成慢性肾衰竭的主要过程之一。再者，氧化压力亦被认为是主要造成病患中及动物模型中IgAN增加及发展的因子；曾有研究指出，在多数的人类及实验性肾病中（包括IgAN），活性氧（ROS)会直接引发疾病。
当然醋酸皮质固醇（glucocorticoid steroid)已广泛愿用在治疗IgAN病患，但其对于IgAN之维持肾功能且减缓尿蛋白之效果仍不清楚，且因长期使用所引起的无法控制的抑制免疫反应之副作用，仍造成用上的难题。
目前许多之实验已得知牛樟芝萃取物具有诸多医疗功效，且其所含成分亦陆续被分析出，但牛樟芝萃取物中是否具有其他可有效治疗肾疾病的化合物，仍是值得待解决之一课题。
一氧化氮（Nitric oxide，NO)为自由基，在多种类型的肾小球肾炎中扮演重要的致病角色。细菌内毒素脂多糖体（lipopolysaccharide，LPS）和细胞激素可诱发肾小球间质细胞（mesangial cells）中诱发型一氧化氮合成酶；（inducible nitric oxide synthase，iNOS）表现及大量NO生成，直接参与肾小球发炎反应。除此，NO在体内可经由扮演信息传递者之角色来调控促发炎基因或转录因子的表现，多方面地参与肾小球肾炎之发生。抑制iNOS表现或活性可能是治疗肾小球肾炎的有效策略。牛樟芝是传统使用的真菌类，它曾被认为具有抗氧化、抗癌以及免疫调节等功效。
本实验研究的目的即探讨牛樟芝通过抑制由细菌内毒素脂多糖体（lipopolysaccharide，LPS)诱发肾小球间质细胞（mesangial cells）的发炎反应及治疗肾小球肾炎的可行性。
1 材料与方法
1.1 试药剂
牛樟芝萃取物由兰亭生物科技有限公司提供。取牛樟芝菌丝体以10倍量的酒精抽取2次合并供浓缩得到一粗提取物（ACE），将粗提取物以二氯甲烷/水（1：1）进行分配萃取法3次，以分为二氯甲烷层及一水层，取该二氯甲烷层以硅胶柱层析法经正己烷/二氯甲烷（1：4）、二氯甲烷、甲醇/二氯甲烷（5：95）的溶剂分离得到该萃取物（Antrocamols）。
1.2 试方法
- 细胞培养。老鼠肾细胞株CRL-1927来自美国菌种保存中心（The American Type Culture Collection；Manassas, Virginia, USA）。细胞培养在DME培养基（Dulbecco's modified Eagle's medium) Ham's F-12 medium（BioWhittaker, Walkersville, MD）3:1的混合培养基中。培养基添加5%胎牛血清及14mMHEPES缓冲溶液(5% fetal bovine serum and 14mM HEPES)。
- 测量细胞内ROS的产生。通过检测荧光强度的2,7-二氯二氢荧光素的氧化物（2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯；分子探针，尤金），来测定细胞内活性氧的产生。肾小球间质细胞加入用纯提取物2,7-二氟二氢荧光素二乙酸酯（2μM)及LPS(LPS所诱发的NO生成）溶液共培育30分钟，然后检测荧光强度，2，7-二氯二氢荧光素可检测到一个激发波长在485nm，在微量培养板的吸光度阅读器（Bio-Rad公司实验室，Inc 制造）上的发光波长为530nm。
- 酶免疫assay MCP-1在培养物上清液中的蛋白的测定：使用商业ELISA试剂盒（Biosciences公司，洛杉矶，CA，USA)按照制造商的说明。在450nm处的吸光度测定用ELISA板计数器（Bio-Tek公司）。
2 结果
利用肾小球间质细胞（Mesangial cell)检测平台测牛樟芝酒精提取物（ACE)：结果显示在5分钟内浓度在0.024mg/ml时，可降低由LPS所诱发的氧化压力。
利用巨噬细胞（Macrophage cell）检测平台侦测牛樟芝酒精提取物（ACE)：结果显示在5分钟内浓度在0.78125mg/ml时，可降低由LPS所诱发的氧化压力。
利用肾小球间质细胞（Mesangial cell）检测平台侦测牛樟芝萃取物Antrocamol LT1 (ANCA-D-34)：结果显示在≤0.048mg/ml浓度均不影响肾小球间质细胞生长，将以0.048mg/ml进行抑制氧化压力（ROS)分析，结果显示在5分钟内0.048mg/ml可以抑制氧化压力14%。0.012mg/ml可以抑制氧化压力3%。
利用肾小球间质细胞（Mesangial cell)检测平台侦测牛樟芝萃取物（ANCA-D-33)：结果显示在≤0.048mg/ml浓度均不影响肾小球间质细胞生长，将以0.048mg/ml进行抑制氧化压力（ROS)分析，结果显示在5分钟内0.048mg/ml可以抑制氧化压力12.5%。
利用肾小球间质细胞（Mesangial cell)检测平台侦测牛樟芝萃取物（ANCA-D-25）：结果显示在≤0.048mg/ml浓度均不影响肾小球间质细胞生长，将以0.048mg/ml进行抑制氧化压力（ROS)分析，结果显示在5分钟内0.048mg/ml可以抑制氧化压力12%，0.012mg/ml可以抑制氧化压力5%。
由实验结果牛樟芝酒精提取物（ACE）对于肾小球间质细胞（Mesangial cell）及巨噬细胞（Macrophage cell)都可降低由LPS所诱发的氧化压力。目前测试了六种牛樟芝纯化物，以0.048mg/ml和0.012mg/ml做氧化压力与发炎反应分析，以Antrocamol LT1 (ANCA-D-34）的抑制氧化压力效果最好，以Antrocamol LT3 (ANCA-D-352)的抑制发炎反应效果最好。
3 讨论
牛樟芝酒精提取物（ACE）对于肾小球间质细胞（Mesangial cell）及巨噬细胞（Macrophage cell)都可降低由LPS所诱发的氧化压力。牛樟芝的纯化物也能抑制肾小球间质细胞由LPS所诱发的氧化压力及抑制发炎反应。
一氧化氮（Nitric oxide，NO)为自由基，在多类型的肾小球肾炎中扮演重要的致病角色。细菌内毒素脂多糖体（lipopolysaccharide，LPS）和细胞激素可诱发肾小球间质细胞（mesangial cells）中诱发型一氧化氮合成酶；（inducible nitric oxide synthase，iNOS）表现及大量NO生成，直接参与肾小球发炎反应。牛樟芝可能通过抑制氧化氮合成酶；（inducible nitric oxide synthase，iNOS）的表现及抑制NO的生成，而抑制肾小球间质细胞由LPS所诱发的氧化压力及抑制发炎反应。因此牛樟芝是值得再深入研究探讨及研发成治疗肾小球发炎的新药。（作者：曾完平1，郭盈好2，曾泰霖，李志明2，曾卉菱3 。1.南京中医药大学；2.兰亭生物科技有限公司；3.私立中国文化大学中国文学系；4.澳门大学）
