摘 要 目的: 研究牛樟芝滴丸对大鼠非酒精性脂肪肝(NAFLD) 相关基因表达的影响。
方法: SD 大鼠48只,随机分成6组:正常对照组,模型组,水飞蓟素组(20 mg·kg^-1),牛樟芝滴丸高、中、低剂量组(320、160、80 mg·kg^-1),造模成功后给药6周。实验结束后,分别测定大鼠肝组织脂肪酸合成酶(FAS)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPAR-α)、固醇调节元件结合蛋白1c(SREBP-1c)的mRNA和蛋白表达。
结果: 与模型组比较,牛樟芝滴丸低剂量组SREBP-1c mRNA和蛋白表达以及FAS蛋白表达显著降低(P < 0.05,P < 0.01),但FAS mRNA表达无显著差异; PPAR-α蛋白表达显著升高(P < 0.01),PPAR-αmRNA表达与ACC mRNA和蛋白表达均无统计学意义; 中、高剂量组SREBP-1c、FAS mRNA和蛋白表达均显著降低(P < 0.05,P < 0.01),而PPAR-α、ACC mRNA和蛋白表达均显著升高(P < 0.01)。
结论: 牛樟芝滴丸对大鼠NAFLD的相关基因表达具有明显的影响。
关键词: 牛樟芝滴丸;非酒精性脂肪肝;脂肪酸合成酶;乙酰辅酶A羧化酶;过氧化物酶体增殖物激活受体α;固醇调节元件结合蛋白1c;大鼠
牛樟芝(Antrodia camphorata) 又名牛樟菇,为台湾特有的药用真菌,具有抗氧化、抗炎、解毒保肝等作用[1-2]。课题组前期研究表明牛樟芝滴丸能增加机体超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量,加快清除自由基,调节脂质代谢,减轻脂质过氧化和细胞浸润,抑制炎性因子分泌,增强肝脏抗氧化能力[3]。为探讨牛樟芝滴丸治疗大鼠非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)的抗氧化作用机制,进行了本实验研究。
1 材料与方法
1.1 实验动物 Spague-Dawlay(SD)雄性大鼠,体重(200 ± 20) g,购自浙江省实验动物中心,生产许可证号: SCXK(浙) 2014-0001。饲养于福建中医药大学实验动物中心SPF级动物饲养室,使用合格证: SYXK(闽) 2014-005,室温(22 ± 2) ℃,湿度(60 ± 5) %,喂饲标准颗粒饲料,自由饮水和摄食。
1.2 药物与试剂 牛樟芝滴丸: 实验室自制(总三萜含量: 2.09%); 水飞蓟素: Sigma公司。Trizol: 美国Invitrogen公司; RNasin、DNTPs、PCR buffer: 美国Promega公司; SYBR Green PCR Master Mix: 日本Toyobo公司; FAS、ACC、PPAR-α、SREBP-1c: Cell Signaling Technology; 其他试剂均为AR级。
1.3 仪器 BP211D电子天平: 上海精天天平厂; DL-5M高速冷冻离心机: 德国Sartarius公司; Eppendorf Centrifuge5415R冷冻离心机: 德国Sigma公司; GSY-8电热恒温水浴锅: 北京医疗设备厂意成公司; FSH-2型可调高速匀浆器: 江苏金坛市荣体仪器制造有限公司; Powerpac300型电泳仪: 美国BIO-RAD公司; 压缩机制冷式基因扩增仪: 珠海黑马仪器有限公司; GSG核酸/蛋白凝胶图像分析管理系统: 珠海黑马仪器有限公司; Multiskan MK3酶标仪: 上海雷勃分析仪器有限公司; 8543紫外/可见分光光度计: 美国安捷伦公司; SW-CJ-IF型超净工作台: 江苏苏州安泰空气技术有限公司; XW-80A旋涡振荡器: 上海精科实业有限公司; 实时PCR系统: 美国Applied Biosystem公司。
1.4 动物分组、模型制备与给药方法[3] SD雄性大鼠饲养1周后,随机分为6组,每组8只。正常对照组予以普通饲料; 模型组、牛樟芝滴丸(320、160、80 mg·kg^-1)组、水飞蓟素组(20 mg·kg^-1)每天上午给予脂肪乳剂(10 mg·kg^-1,参照文献并加以改进[4])灌胃并给予足量的18%蔗糖溶液。3周后,每天下午予以相应的药物(正常组和模型组给予等量的CMC-Na)灌胃。每周称体重2次,调整灌胃量,至第9周末。
1.5 标本采集 给药结束后,所有大鼠禁食24h后,麻醉,取肝脏,生理盐水漂洗,滤纸吸干,备用。
1.6 肝组织相关mRNA表达的实时荧光定量检测 Trizol试剂提取肝组织总RNA,按照试剂盒说明书操作步骤,获得cDNA产物,进行PCR反应,β-actin为内参。引物由上海introvigen公司合成,如表1。SREBP-1c、FAS、ACC、PPAR-α mRNA表达分析采用Real-Time PCR SYBR荧光染料法测定,配置20 μL体系,具体操作参照试剂盒说明书,每个样品3个重复。循环条件为: 预变性94℃ 30s; PCR反应94℃ 5s,60℃ 34s(共40循环),待反应结束后,采用ABI 7500荧光定量PCR仪上的软件进行数据的分析处理。其中以正常组的基因表达设为1。
1.7 肝组织相关蛋白的WesternBlot法检测 取肝组织加入适量的裂解液,于4℃,10,000 × g离心15 min,取上清。利用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白含量测定,将定量好的蛋白进行变性,冷却后置-80℃低温冰箱贮存。样品经SDS-PAGE分离,转膜,封闭后,分别孵育相应的一抗和二抗后进行曝光与显影。采用Image Pro-plus program软件分析目的条带。
1.8 数据分析 本实验中数据均采用SPSS 18.0统计软件进行统计分析,以(x ± s)表示,不同组间采用单因素方差分析,以P < 0.05判定为具有统计学意义。
2 结果
2.1 牛樟芝滴丸对非酒精性脂肪肝大鼠肝组织FAS、ACC、PPAR-α和SREBP-1c mRNA表达的影响 与正常组比较,模型组SREBP-1c、FAS mRNA表达明显增加(P < 0.05,P < 0.01),ACC、PPAR-αmRNA表达明显降低(P < 0.05,P < 0.01);与模型组比较,牛樟芝滴丸低剂量组SREBP-1c mRNA表达有降低(P < 0.05),而FAS、ACC、PPAR-αmRNA表达无差异,中、高剂量组SREBP-1c、FAS mRNA的表达显著降低(P < 0.05,P < 0.01)。
2.2 牛樟芝滴丸对非酒精性脂肪肝大鼠肝组织ACC、PPAR-α、FAS、和SREBP-1c蛋白表达的影响 与正常组比较,模型组SREBP-1c、FAS蛋白表达明显增加(P < 0.01),ACC、PPAR-α蛋白表达明显降低(P < 0.01);与模型组比较,牛樟芝滴丸低剂量组ACC蛋白表达无显著差异,PPAR-α蛋白表达明显增加(P < 0.01),而FAS、SREBP-1c蛋白表达明显降低(P < 0.01);中、高剂量组ACC、PPAR-α蛋白表达显著升高(P < 0.01),而FAS、SREBP-1c蛋白表达显著降低(P < 0.01)。
3 讨论
NAFLD是一种常见的慢性肝脏疾病,按病程可分为单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎及相关肝硬化[5]。若发展至NAFLD,则难以逆转,且目前尚无有效治疗措施[6]。有研究表明NAFLD的发病与以下因素有关:脂质过氧化、氧化应激过高、脂质代谢异常及胰岛素抵抗等[3]。
本实验前期研究发现牛樟芝滴丸对大鼠NAFLD具有保护作用[3]。众所周知,肝脏脂肪酸代谢过程较为复杂,主要包括脂肪动员、脂肪酸活化、脂肪酸和三酰甘油合成、β-氧化以及脂肪酸的转运等,这些过程涉及到多种关键酶(如: ACC、FAS)和转录因子(如: SREBP-1c、PPAR-α)。PPAR-α是PPARs核受体超基因家族的一种亚型,主要通过诱导脂肪酸转运蛋白(FATP)和脂肪酸转位酶(FAT/CD36)的表达来促进脂肪酸的跨膜转运,以及刺激肝脏及巨噬细胞中脂蛋白脂肪酶(LPL)基因的表达,促进TG的水解[7]。SREBP-1c在脂肪细胞和肝脏组织中表达较高,过度表达引起糖脂代谢紊乱,脂量上升,引起肝脏等非脂肪组织的脂质堆积[8],其调节的靶基因包括ACC、FAS、GK(葡萄糖激酶)、PEPCK(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶)等相关脂肪酸合成和糖代谢基因。
本实验通过对SREBP-1c、FAS、ACC、PPAR-α研究发现牛樟芝滴丸组能显著升高ACC和PPAR-α的mRNA和蛋白表达(P < 0.05,P < 0.01),通过脂肪酸转运蛋白和转位酶对脂肪酸进行转运,从而增加三酰甘油的分解;而对SREBP-1c、FAS的mRNA和蛋白表达则显著降低(P < 0.05,P < 0.01),通过抑制糖脂的过量表达,从而减少脂肪的堆积;而SREBP-1c的靶基因之一FAS,则通过抑制其脂肪酸合成而减少脂肪酸吸收;对于另一靶基因ACC则可能由于SREBP-1c被抑制或是其他信号通路导致其表达升高,通过磷酸化,促进脂肪酸的氧化来调节肝脏脂肪变性。
综上所述,牛樟芝滴丸通过降低大鼠肝脏SREBP-1c、FAS的表达,抑制肝脏脂肪酸吸收和脂肪合成;上调肝脏PPAR-α、ACC表达,促进脂肪酸氧化、肝内脂肪分解等改善大鼠肝脏脂肪变性。( 作者:魏文增,王 宫,吴华嵩 福建省中医药研究院·福建 福州 350003)